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端粒酶活性

端粒酶活性概述

端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构,由一富含鸟嘌呤的重复DNA序列及其相关蛋白组成。端粒是保护染色体末端稳定必不可少的结构。端粒长度的维持需要端粒酶活性的存在。永生细胞和肿瘤细胞能够长期生存,端粒酶起到了重要的作用。端粒酶是由RNA和蛋白体组成的复合体,属一种专一的依赖RNA的逆转录酶,能以自身的RNA为模板,从头合成染色体末端的端粒DNA,弥补细胞分裂时端粒DNA的丢失,维持端粒的长度,保持染色体的动态平衡,使细胞获得永生化。自建立了高敏感度的、以PCR为基础的检测端粒酶的方法以来,端粒酶引起了人们的广泛关注。人们发现,端粒酶与细胞的增生、分化和不死性有着极为密切的关系,已成为目前肿瘤和衰老基础研究的热点之一。 

端粒酶活性正常值

  • 阴性。 

端粒酶活性临床意义

  • 1、肝癌患者有较高的端粒酶阳性率(85%),端粒酶活性阳性者AFP水平明显高于端粒酶活性阴性者。端粒酶活性与肿瘤大小、组织学分级及肿瘤转移无显著相关。端粒酶有可能成为诊断肝癌的肿瘤标志物。
    2、端粒酶在大多数恶性肿瘤组织有较高水平表达,如神经母细胞瘤(94%)、乳腺癌(93%)、大肠癌(93%)、胃癌(85%)、前列腺癌(84%)、肺癌(80%)等。端粒酶活性与肿瘤的临床分期及预后密切相关。因此,端粒酶是目前最特异和具有普遍性的肿瘤标记物。
    3、在少数良性病变(如肝炎、肝硬化、良性脑膜瘤等)组织中可有很弱的端粒酶活性。 

端粒酶活性检查方法

  • 检查操作:
    基因组DNA为0.1μg;缓冲液含50mmol/L氯化钾,10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),1.5mmol/L氯化镁,100μg明胶;每一引物为0.25μmol/L;dATP,dCTP,dGTP,dTIP各为200μmol/L;DNA聚合酶为2.5U,终体积为100μl。加数滴液体石蜡防止蒸发。
    反应周期:
    ①变性:90℃ 30~60s;
    ②引物和模板的退火温度:40~60℃ 30~60s;
    ③延伸:72℃ 1~2min。经反复循环30~40次,最后1次72℃引物延伸7min后终止。除去液体石蜡后,产物可供分析。经琼脂糖凝胶电泳后,用溴乙锭染色,经紫外灯照射可见预料扩增长度的荧光条带。产物也可与放射标记或非放射标记的寡聚核苷酸探针行Southern印迹杂交或点渍印迹杂交。如用PCR自动仪则更为方便,将反应试剂、DNA模板及Taq-DNA聚合酶加入试管后,放进已调好程序,即所需变性→退火→延伸各自的温度和时间及循环次数的自动仪中进行反应,即可获得满意的扩增产物。 

端粒酶活性注意事项

  • 近年来,“端粒、端粒酶假说”已被越来越多的研究所证实,以端粒酶活性水平为肿瘤诊断的生物标志和预后指标。
    1.注意防止实验室污染而出现假阳性或假阴性。
    2.注意去除组织标本中含有的多聚酶抑制剂,减少假阴性。
    3.闪烁分析技术、ELISA法、原位杂交法较TRAP法检测结果更可靠。 

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